基因治疗产品分析检测面临的挑战及应对策略

基因治疗产品在生物制药行业中的发展

当下，全球生物医药产业发展处于快速上升期，后疫情时代的医药健康行业，迎来新一轮的变革与机遇。其中基因治疗药物被认为是未来医药领域发展的“潜力股”，是目前最受关注的创新医药领域之一，随着越来越多的基因治疗产品的上市，以及基因治疗技术的快速发展，基因治疗即将迎来高速发展期。根据Grand View Research, Inc.的一份报告，到2028 年，全球基因治疗市场规模预计将达到100 亿美元，年复合增长率为20.4%。当前，全球已有近40款基因治疗药物获批上市。 

目前在基因治疗领域使用最多的是将人工改造后的病毒（如常用的AAV载体、慢病毒载体、腺病毒载体等）作为治疗性基因的载体，将治疗性基因或核酸片段递送到患者体内相应器官或组织细胞内，如图1所示。随着成百上千种基因治疗临床项目的快速推进，未来几年会有越来越多的基因疗法被推向市场。为了跟上临床研究的快速发展，研发人员正在努力开发和优化更安全、更高效的基因治疗产品生产工艺，与此同时建立更精准、更稳健且更适用于基因治疗产品的分析检测方法，以期望在提高基因治疗产品质量的同时能降低基因治疗药物生产放行的成本。

图1. 通过改造后的病毒载体进行基因递送（图片来源：manufacturingchemist.com）

分析检测方法的精准性和稳健性，在基因治疗产品的新药研发过程中起着至关重要的作用。在工艺开发过程中，对于不同工艺开发阶段的样品，需要分析检测方法具有很好的稳健性和耐用性，以得到准确可靠的检测结果，来指导产品的工艺开发，与此同时，工艺开发的时效性要求高，如遇到检测结果异常，需要经验丰富的分析人员及时找到关键问题及对应的解决方案；在产品生产放行时，需要基于验证/确认后的分析检测方法，且在完整的质量体系支持下提供合规性的检测。基于此，新药研发人员通常会携手专业的检测人员或具有相关经验的分析检测机构，加强分析检测方法的稳健性、耐用性及合规性等性能。

基因治疗产品分析检测的常见挑战与应对策略

1. 产品生物学活性

《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中指出，生物学活性是反映产品质量和临床有效性的重要指标，需建立与产品体内作用机制相同或相关的生物学活性。

基因组治疗类产品种类多且功能各异，需要基于产品本身的目的功能及现有的检测技术手段来设计/开发适用于特定产品的生物学活性评估方法。目前，常通过基因治疗载体转导敏感细胞后表达产物引起的细胞表型或功能变化来评估产品的活性或效能。开发这些活性检测方法需要基于产品功能和特性“具体问题具体分析”，因为没有一种“放之四海而皆准”的检测方法供开发人员使用，例如有的可以通过定量表达产物的活性来测试转导效率或病毒活性；有的产品因检测其产物活性存在困难而只能通过检测产物物理含量来测试其转导效率或产物表达量，例如通过westernblot、流式细胞术、ELISA等检测方法定量表达产物。对于已上市的Zolgensma产品，针对产品的生物学活性主要从两方面进行了评估，一方面评估了靶细胞内目的蛋白的表达量，另一方面采用体内半定量检测的方法评估了小鼠的生存率。

基因治疗类产品的生物活性方法设计和开发总体策略可参考如下示意图进行开发：

图2（图片来自博腾生物）

2. 空壳率检测

基因治疗产品（以AAV产品为例）生产过程中会产生产品相关的一系列杂质，比如空壳AAV、部分空壳AAV等，这些产品相关的杂质不仅会降低产品的有效性，同时也会带来安全性方面的隐患，比如免疫原性等，因此需要设计准确且耐用的分析方法对AAV产品的空壳率进行控制，以保证产品的安全性和有效性。

图3. 图片来源：manufacturingchemist.com

目前市面上有多种方法可用于AAV产品实心率的检测，如AUC、SEC-HPLC-MALS法、AEX-HPLC-UV法、AEX-HPLC-FIR法等，由于检测方法种类多且各方法均有其优略势，方法开发人员或检测人员在进行分析方法选择上会存在诸多困惑。本文中将检测AAV产品实心率的常用方法进行了汇总并分析了其优略势，为检测人员筛选检测方法提供一些策略指导。

图4（图片来自博腾生物）

在一些文献中也对检测AAV产品实心率的分析方法进行了比对，如下图5A示，SEC-MALS方法在检测实心率方面与AUC和TEM检测结果具有较好的可比性；另外，有些文献也对SEC-MALS法、AEX-HPLC-FIR法、AEX-HPLC-UV法的检测结果进行了比对，如图5B示，从图中可以看出SEC-MALS方法与AEX-HPLC-FIR方法检测结果较为接近，而AEX-HPLC-UV方法的检测结果与上述2种方法的差异较大。这是由于实心和空壳AAV样品具有不同的消光系数导致检测结果的差异，因此在使用AEX-HPLC-UV方法时需要引入校正因子以消除空壳和实心样品消光系数的差异带来的检测误差。

图5A

图5B

3. 基因组滴度检测

《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中有强调：为了在保证产品疗效的同时能有效控制产品免疫原性风险，病毒载体类产品的规格或剂量建议以相应体积的病毒总颗粒数或基因拷贝数表示。同时，病毒载体类产品的基因组滴度也是确定临床给药剂量的重要参考，因此需要建立准确的分析方法来检测病毒载体类产品的滴度。

对于AAV产品，目前常用的基因组滴度检测方法为Q-PCR法和ddPCR法；Q-PCR法为相对定量方法，需要基于标准曲线来相对定量产品的基因组滴度，QPCR方法检测结果的准确性易受多方面因素的影响，比如标准品浓度标定的准确性、标准品存储的稳定性、标准品与待测样品基因序列结构的差异性等均会对检测结果带来影响；相较于Q-PCR方法，ddPCR为绝对定量方法，无标准品的影响，定量结果的准确性和精密度更高。

图6（图片来自博腾生物）

如下图所示，博腾生物对Q-PCR法和ddPCR法2种方法的重复性进行了考察，与Q-PCR法相比，ddPCR法具有更好的重复性；同时分析研发团队也对QPCR方法中不同的标准品构型进行了比较，发现线性和超螺旋质粒标准品的标曲会存在较大差异，不同的标注品构型对定量基因组滴度会存在较大的影响。

图7A（图片来自博腾生物）

图7B（图片来自博腾生物）

4. rcAAV残留检测

法规要求，对于非复制型或条件复制型病毒载体，应选择最适宜的样品，采用敏感的分析方法检测工艺过程种产生的可复制型或野生型病毒，因此需要建立灵敏的方法监控rcAAV的残留，以保证产品的安全性。

目前，一般采用AAV样品感染敏感细胞结合QPCR分析的检测方法检测rcAAV。由于AAV是条件复制型病毒载体，因此需要ad5等辅助病毒对AAV进行辅助感染，在开法rcAAV残留检测方法中需要建立ad5腺病毒阳毒库，并按照检定用毒种库进行管理。此外，在rcAAV残留检测中也会用到阳性对照品，因此也需要建立不同血清型的野生型AAV阳毒，并对其进行标定后按照对照品进行管理。

在rcAAV残留检测方法开发过程中的难点与挑战主要集中在几个方面：1.检定用辅助阳毒库的建立和管理；2.不同血清型wtAAV对照品的制备；3.毒种库的保存稳定性考察；4.阳性对照品的保存稳定性考察。截至目前，博腾生物已建立了ad5的辅助阳毒库（原始病毒库、主病毒库和工作病毒库），并严格按照鉴定用毒种库的要求进行管理；同时也已建立了常见血清型的wtAAV对照品并进行了标定，可为客户进行rcAAV残留检测的支持。

图8（图片来自博腾生物）

对于rcAAV残留检测，除采用ad5辅助病毒进行辅助感染外，也可考虑采用无阳性辅助病毒的辅助体系进行辅助感染，比如采用辅助质粒进行感染、采用10-50mM丁酸钠作为促感染试剂进行辅助感染等。目前博腾生物已在积极推进和开发无ad5阳性辅助病毒体系进行rcAAV残留检测的方法，以期在未来建立高灵敏度且无ad5阳性辅助病毒的rcAAV残留检测方法。

基因治疗产品商业化推进的阻力

1. 高昂的研发生产成本

与其他药物相比，基因疗法非常昂贵。除了漫长的新药研发周期外，因缺乏先进的生产技术和商业规模的器具设备，基因治疗药物的生产及后期distribution都极具挑战及复杂性。高昂的成本和技术问题带来的挑战成为主要的商业化推进阻碍之一。开发人员在药物基础研究，工艺研发和生产方面进行了大量的前期投资，这些投资最终细化到了患者身上。专门从事分析检测的实验室旨在标准化及简化流程，以降低基因治疗药物生产成本，从而减轻患者及其家属的经济负担。

图9（图片来自博腾生物）

2.缺乏完善的指导性方针

基因治疗是一个新兴领域，相关产品种类多样，成分复杂，基因递送载体和基因编辑等生物技术发展快速，因此对于提高基因治疗CMC效率的指导方针还未得到足够的完善，行业内相关的研发人员急需更加完善的指导性文件，这需要包括研发人员在内的相关人员的共同努力。目前人们正在努力标准化过程，以便更好地比较载体的质量，希望最终建立通用的剂量单位。目前急需要开发出更强大的分析测定方法，以确保基因疗法开发和随后输注给患者时质量控制的一致性。

3.不断更新换代的行业标准

此外，由于该技术的新颖性，用于分析评估基因疗法质量的行业标准也在不断变化。直到2020年1月，FDA才为相关研发人员发布了七项新指南，值得注意的是，早期的基因疗法参与者视此指南为最低要求，目前他们在开发基因疗法时正在努力使产品达到更高的质量标准，并乐于分享关键发现以制定未来的行业标准。通过引入新的法规或监管改革，我国及全球其他国家开始支持本地细胞与基因治疗技术的发展。在另一方面，全球各地的监管要求不一一相同，尤其是对于细胞及基因治疗产品在行业内标准的不明确，一定程度阻碍高效产品研发到商业化的执行。但随着监管机构对审查基因疗法越来越熟悉，其商业化之路将走得更快。不可否认，基因疗法将为患者带来不可思议的收益，但是对于提高生产效率和降低成本，使基因疗法更容易且更广的惠及患者，至关重要。

把握基因治疗市场的关键机遇

权衡配备基础设施早期投资的巨大成本和潜在产品研发及成产中的风险点，越来越多生物制药公司及研究机构开始与CDMO平台合作，以节省大量前期资金投入和满足快速推进产品上市的需求。与专注于药物研发的生物制药公司相比，成熟的CDMO企业无论是在工艺生产与设计、产品质量分析检测，还是申报材料的准备与沟通上，都具备更充足的资源与更丰富的经验。以客户需求为导向，博腾生物旨在携手客户把握行业的最新机遇，基于前沿的知识和先进的基因治疗技术平台，通过建立战略性合作模式，提供安全可靠的技术及知识转移流程，灵活的合作范围，达到供应链的简化，帮助客户在竞争逐渐激烈的基因治疗市场和疫情的大环境下提升对抗不确定因素的敏捷反应能力。

博腾生物搭建了针对CGT产品的CDMO平台，覆盖质粒、细胞治疗、基因治疗、溶瘤病毒、核酸治疗及活菌疗法等，提供从建库，工艺方法及分析方法开发，cGMP生产到制剂灌装的端到端服务，贯穿早期研究、研究者发起的临床、新药临床试验申请（IND）、注册临床试验到商业化生产等不同药物阶段，帮助客户加快药物研发与上市进程。为支持基因与细胞治疗产品全生命周期、满足更多客户的需求，助力行业发展，博腾生物倾情巨献，近期正式推出“分析检测与咨询服务”！

为支持基因与细胞治疗产品全生命周期、满足更多客户的需求，助力行业发展，博腾生物倾情巨献，正式推出「分析检测与咨询服务」!为GCT产品药学研究保驾护航
加速转化自成立以来，博腾生物与客户携手奋进，砥砺前行，现阶段已有多个客户的项目进入中国Pre-IND阶段或取得IND默许批件。完善的分析检测平台，为博腾生物端到端的基因与细胞治疗CDMO服务提供强大的支持，目前已为超过20个CGT管线提供基于DOE的分析方法开发和高效精准的检测服务。

分析检测团队在物理化学、生物物理学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和蛋白质生物等领域有着丰富的经验；同时，平台配备了先进的仪器设备，具备GCT产品的一般特性、鉴别、纯度、含量/效价和杂质/残留和安全性等检测能力。

博腾生物基于丰富的CMC药学研究与成功经验，以客户需求为导向，现正式对外提供分析检测与咨询服务，为有分析方法开发、检测和咨询需求的企业提供支持。√1.IND申报分析方法开发与检测服务

• 旨在应对客户 IND 申报过程中的法规合规性、质量体系合规性、 申报资料繁琐性、人员培训和前期大量设备投资的挑战。

• 博腾生物提供一站式IND申报分析研究与检测的策略、执行和项目管理服务。

√2.IIT产品检测服务

• 旨在应对非注册临床阶段对IIT产品分析检测时效性、准确度及方法稳健性要求极高的挑战。
  

• 博腾生物提供一站式、针对非注册临床产品的分析研究与检测的策略和执行服务。

√3.检测服务

• 提供合规性检测和普通检测服务，分别覆盖临床到商业化，药物研发到商业化阶段。

• 博腾生物成功开发了针对质粒、病毒、细胞、mRNA及活菌等不同种类GCT产品的系统化平台检测方法，截至目前已超过260项。

√4.客户定制服务

• 博腾生物具备完善的分析检测平台、专业的检测团队及多样化的高端分析检测仪器设备，可根据客户需求提供个性化定制， 包括复有需求针对性的方法开发定制服务及灵活性高的服务项组合方案。
  

√5.技术咨询服务

• 基于丰富的国内外法律法规知识与多项申报经验，博腾生物可提供个性化技术咨询和培训服务，为客户提前规避风险，梳理申报困惑，从而进行更高效的基因与细胞疗法的申报策略规划。

260+检测项目清单
博腾生物已成功开发了针对质粒、病毒、细胞、mRNA及活菌等不同种类GCT产品的系统化平台检测方法，截至目前已超过260项。

1. 质粒分析检测服务项目清单

2. mRNA分析检测服务项目清单

3. 慢病毒分析检测服务项目清单

4. 细胞治疗产品分析检测服务清单

5. AAV分析检测服务项目清单

6. 溶瘤病毒分析检测服务项目清单

7. 活菌分析检测服务项目清单

如需260项平台检测方法清单，请关注下方博腾生物公众号、微信留言“分析检测服务清单”，并填写表单信息：

通过下述联系方式，可获得更多产品或服务信息：联系电话：[phone]联系邮箱：[e-mail]

网址：www.portonadvanced.com

关于博腾生物

苏州博腾生物制药有限公司成立于2018年12月，立足于苏州工业园区，以上市公司-重庆博腾制药科技股份有限公司（股票代码：300363）为依托，搭建了质粒、细胞治疗、基因治疗、溶瘤病毒、核酸治疗及活菌疗法等CDMO平台，提供从建库，工艺方法及分析方法开发，cGMP生产到制剂灌装的端到端服务，贯穿早期研究、研究者发起的临床、新药临床试验申请（IND）、注册临床试验到商业化生产等不同药物阶段，帮助客户加快药物研发与上市进程。博腾生物聚焦基因与细胞治疗，在博腾股份的成功经验之上，以国际一流的专业人才为核心，秉承“客户第一”的服务宗旨，以“合规、专业、专注、开放协作”为品牌理念，延续母公司强大的IP保护和项目管理机制以及完善的质量管理体系，充分利用核心团队将基因和细胞治疗产品推向临床直至上市的成功经验，为全球客户提供优质和高效的服务，让好药更早惠及大众。。

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13. Estimationof empty and full AAV10 particle ratio using the multi-angle lightscattering detector

14. Comparisonof analytical techniques to quantitate the capsid content ofadeno-associated viralvectors

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